在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中,Western Blot(免疫印跡試驗(yàn))是一種常用的技術(shù),用于檢測(cè)和比較不同條件下蛋白質(zhì)的表達(dá)量。在這一過(guò)程中,內(nèi)參抗體的選擇至關(guān)重要,因?yàn)樗苯佑绊懙綄?shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。本文將探討內(nèi)參抗體選擇的關(guān)鍵因素及其應(yīng)用指南。
一、內(nèi)參抗體的定義與重要性
內(nèi)參抗體,也稱為內(nèi)部參照抗體,是用于Western Blot實(shí)驗(yàn)中校正和標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果的輔助抗體。它們通常由管家基因編碼,這類基因在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定,不受外部條件變化的顯著影響。內(nèi)參抗體不僅用于校正蛋白質(zhì)定量和上樣過(guò)程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差,還作為空白對(duì)照,監(jiān)測(cè)整個(gè)Western Blot實(shí)驗(yàn)的體系是否正常。
二、選擇內(nèi)參抗體的關(guān)鍵因素
1.物種來(lái)源
-哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞樣本:常用的內(nèi)參包括β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3等。
-植物來(lái)源樣本:可以選擇Plant actin、Rubisco等內(nèi)參。
-其他稀少物種:通過(guò)查詢相關(guān)文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫(kù),選擇合適的蛋白作為內(nèi)參。
2.目的蛋白的分子量
-內(nèi)參蛋白的分子量應(yīng)與目的蛋白相差5kDa以上,以防止檢測(cè)時(shí)信號(hào)重疊。例如,若目的蛋白分子量為45kDa,則不宜選擇β-actin(42kDa)作為內(nèi)參,而應(yīng)考慮GAPDH(36kDa)或β-tubulin(55kDa)。
3.實(shí)驗(yàn)環(huán)境
-考慮實(shí)驗(yàn)樣本是否受到特定生理?xiàng)l件(如缺氧、糖尿?。┗?qū)嶒?yàn)處理(如抗癌藥物)的影響,這些條件可能會(huì)改變內(nèi)參蛋白的表達(dá)量。例如,在糖尿病研究中,GAPDH的表達(dá)可能增高,不適合作為內(nèi)參。
4.蛋白表達(dá)位置
-不同細(xì)胞器或組織部位的內(nèi)參蛋白不同。例如,核蛋白檢測(cè)時(shí),可選擇Lamin A、Lamin B、Histone H3等核內(nèi)參;線粒體蛋白檢測(cè)時(shí),可選擇VDAC1和COX IV作為內(nèi)參。
5.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>
-在細(xì)胞增殖相關(guān)實(shí)驗(yàn)中,c-Jun由于自身表達(dá)變化,不適合作為內(nèi)參;在凋亡實(shí)驗(yàn)中,TBP、Lamin等也不適合作為核內(nèi)參。
三、應(yīng)用指南
1.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
-在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案時(shí),應(yīng)綜合考慮上述因素,并查詢相關(guān)文獻(xiàn),選擇最合適的內(nèi)參抗體。
-確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作規(guī)范,避免由于技術(shù)原因?qū)е碌恼`差。
2.實(shí)驗(yàn)過(guò)程
-在Western Blot實(shí)驗(yàn)中,按照常規(guī)步驟進(jìn)行蛋白提取、電泳、轉(zhuǎn)膜和抗體孵育。
-若目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量差異不大,可采用分步孵育的方法,即先檢測(cè)目的蛋白,然后洗去膜上的抗體,再孵育內(nèi)參抗體。
3.結(jié)果分析
-觀察內(nèi)參蛋白和目的蛋白的條帶強(qiáng)度和位置,確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
-若內(nèi)參表達(dá)出現(xiàn)異常,應(yīng)及時(shí)分析原因,并考慮更換內(nèi)參抗體。
4.注意事項(xiàng)
-內(nèi)參抗體的選擇應(yīng)具有通用性和穩(wěn)定性,以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性和可比性。
-在處理特殊樣本(如分泌液、紅細(xì)胞等)時(shí),應(yīng)選擇合適的內(nèi)參蛋白或采用其他方法作為參照。
內(nèi)參抗體的選擇是Western Blot實(shí)驗(yàn)中一個(gè)至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。通過(guò)綜合考慮物種來(lái)源、目的蛋白分子量、實(shí)驗(yàn)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡纫蛩兀x擇最合適的內(nèi)參抗體,可以顯著提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,應(yīng)嚴(yán)格遵循操作規(guī)范,注意細(xì)節(jié)處理,確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度。